En la «Sociedad 5.0», propuesta por la Oficina del Gabinete como la sociedad a la que Japón debería aspirar en el futuro, la gran cantidad de información obtenida a través de sensores se analizará en grandes datos y se transmitirá a los humanos en diversas formas. Especialmente en los últimos años, con un mayor interés en la atención sanitaria, la monitorización en tiempo real y la detección múltiple de materiales biológicos han atraído la atención. Entre ellos, los biosensores electroquímicos basados en el sistema integrado de reacción enzimática y reacción de electrodos pueden detectar sustancias objetivo con alta selectividad en condiciones suaves y se utilizan prácticamente en sensores de nivel de azúcar en sangre y otras aplicaciones. En particular, las reacciones de «transferencia directa de electrones (DET)», en las que una enzima transfiere directamente electrones a un electrodo, son sistemas de reacción simples que consisten únicamente en una enzima y un electrodo y, por lo tanto, son más compatibles con el medio ambiente y el medio ambiente. , además de la libertad de diseño, se puede diseñar un biosensor cada vez mejor (biosensor de tercera generación). Sin embargo, sólo se han informado de unas 30 enzimas capaces de realizar esta reacción y sólo se puede cuantificar un número muy pequeño. Además, debido a que se desconoce el mecanismo detallado, el desarrollo estratégico de enzimas y la búsqueda de enzimas son difíciles, lo cual es uno de los principales desafíos para la aplicación práctica.
Hemos desarrollado nuevas enzimas de tipo DET con fructosa deshidrogenasa (FDH), que tiene una fuerte actividad catalítica de tipo DET, como enzima modelo. Esta enzima es una subunidad catalíticamente activa que contiene dinucleótido de flavina adenina (FAD) como sitio catalítico.CEs un heterotrímero que consta de una subunidad de transporte de electrones que contiene una enzima y una subunidad responsable de la expresión de la enzima (Figura 1). Debido a su destacada actividad, la FDH ha sido ampliamente investigada desde una perspectiva tanto fundamental como aplicada. Además, en 2022 logramos realizar un análisis estructural mediante microscopía crioelectrónica, lo que permitió debatir sobre la base de información sobre la estructura general de la enzima. Por lo tanto, investigamos el mecanismo detallado de la reacción catalítica de FDH desde las perspectivas de la biología estructural y la ciencia computacional.
Figura 1. Diagrama esquemático de la estructura tridimensional y vía de transferencia de electrones de la FDH.
2-1 Identificar los residuos de aminoácidos involucrados en la catálisis de FDH utilizando ciencia computacional, análisis estructural y bioquímica.
Los resultados de las simulaciones de acoplamiento y las búsquedas de homología sugirieron que los tres residuos de aminoácidos objetivo de la mutación (N1146, H1147, N1190) son importantes para el reconocimiento del sustrato enzimático y las reacciones catalíticas. Por lo tanto, generamos mutantes en los que estos residuos de aminoácidos fueron reemplazados por otros diferentes mediante mutagénesis dirigida al sitio. Como resultado de la caracterización de estos mutantes mediante mediciones electroquímicas y microscopía crioelectrónica (utilizando una del Instituto de Investigación Colaborativa JEOL YOKOGUSHI, Escuela de Graduados en Biociencias Fronterizas de la Universidad de Osaka), se observaron cambios en las enzimas mutantes. Afinidad del sustrato y actividad enzimática. La Figura 2 (A) resume las funciones de los residuos de aminoácidos en los que nos centramos. Debido a que la mutación para N1146 redujo la afinidad por el sustrato original fructosa mientras conservaba la actividad enzimática, esperábamos un cambio en la especificidad por un sustrato diferente. Como resultado de verificar la reactividad con otros azúcares, se confirmó que reemplazar N1146 con un residuo de glutamina (Q) (N1146Q) mejoró la reactividad con tagatosa, que tiene una estructura similar a la fructosa (Figura 2 (b)).
Figura 2. (A) Componentes implicados en la reacción catalítica de FDH, (B) reactividad con tagatosa.
2-2 Interpretación y predicción de la selectividad del sustrato mediante simulaciones de acoplamiento
Las estructuras tridimensionales de todos los nuevos mutantes generados se analizaron mediante microscopía crioelectrónica y se realizaron simulaciones de acoplamiento. La Figura 3 (A) es un ejemplo de los resultados de la simulación y pudimos confirmar el enlace de hidrógeno necesario para reconocer la fructosa. Además, como se muestra en la Figura 3(B), según la fórmula teórica, la puntuación de atraque (DS) está determinada por la constante de Michaelis (kM) mostró buena correlación con log. Esto significa que la selectividad del sustrato se puede predecir a partir de la estructura tridimensional de la enzima. Por otro lado, también verificamos si la estructura predicha generada por computadora podría reproducir los resultados reales del análisis. En consecuencia, como lo muestra la línea de puntos roja en la Fig. 3 (B), el resultado difiere del cálculo que utiliza la estructura del microscopio crioelectrónico, lo que indica que todavía hay margen de mejora en la predicción de estructuras basada en computadora. He logrado avances significativos en los últimos años.
Figura 3. (A) Simulación de acoplamiento FDH, (B) Correlación entre DS y la constante de Michaelis.
Esta investigación aclara el mecanismo catalítico de la FDH mediante la fusión de la ciencia computacional de proteínas, el análisis estructural y la bioquímica, y servirá como base educativa que conducirá al desarrollo de un biosensor de tercera generación hecho a medida que utilice la FDH como enzima modelo. En el futuro, según la información obtenida en este momento, combinaremos métodos de predicción de reacciones y aprendizaje automático basados en computadora para modificar en gran medida la especificidad del sustrato del sitio activo catalítico y analizar biomateriales altamente sensibles y compuestos útiles que puedan sensibilizarse con alta eficiencia. Por lo tanto, esta investigación no solo tiene un alto valor académico, sino que también acelera el desarrollo de catalizadores a través de la colaboración interdisciplinaria y la implementación social de biosensores de tercera generación, contribuyendo a la realización de una sociedad sostenible y amigable con el medio ambiente y los organismos.
<தாள் தலைப்பு மற்றும் ஆசிரியர்>
Título: Elucidación estructural y electroquímica de los mecanismos bioquímicos de la D-fructosa deshidrogenasa de tipo transferencia directa de electrones
(Aclaración del mecanismo catalítico de la fructosa deshidrogenasa de transferencia directa de electrones mediante métodos estructurales y electroquímicos)
Autor: Eole Fukawa, Yohei Suzuki, Taiki Adachi, Tomoko Miyata, Fumiaki Makino, Hideaki Tanaka, Keiichi Namba, Keisei Sowa, Yuki Kitazumi, Osamu Shirai
Revista: Acta electroquímica490, 144271 (2024), DOI: 10.1016/j.electacta.2024.144271.
Esta investigación fue apoyada por la Agencia Japonesa para la Investigación y el Desarrollo Médico, la Fundación AMED BINDS (JP22ama121003), la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia, Subvención para la Investigación Científica (JP21H01961, JP22K14831), JST Innovative GX Technology Creation Project (GteX) ( JPMJGX23B4), Kyoto Este evento fue apoyado por donaciones a la Universidad (Sr. Hiroo Kaku, Sr. Wang Holong y Sr. Yasunori Hamano).
